无抗生素+++

氨苄青霉素++﹣

四环素+﹣﹣

氨苄青霉素+四环素+﹣﹣

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是目的基因反向连接。

【考点】Q2：基因工程的原理及技术

【专题】111：图文信息类简答题；548：基因工程．

【分析】基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因（tetr）。

【解答】解：（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是﹣GATATC﹣，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。

（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。

（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。

（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。

故答案为：（1）平 胸腺嘧啶（T） DNA连接

（2）B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒

（3）乙丙 目的基因反向连接

【点评】解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤﹣构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。