【专题】147：探究实验条件；541：微生物的分离、培养和应用．

【分析】据图分析，①称量土样，里面含有需要分离的酵母菌；②表示梯度稀释，③④表示平板划线法，进行纯化培养；⑤表示扩大培养，获得更多的酵母菌。

【解答】解：（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量、溶化，调节培养基的PH，及时对培养基进行分装，高压蒸汽灭菌。

（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将培养基温度冷却到50℃倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。

（3）a．接种针、接种环使用前都必须灭菌，做到无菌操作，a正确；

b．划线时应避免划破培养基表面，大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，b正确；

c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中甲醇的含量，c错误；

d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d正确。

故选：abd。

（4）步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应，促进有氧呼吸，进而大量繁殖。活细胞膜具有选择透过性，经等体积台盼蓝染液染色，无色细胞才计数；为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，则n÷80×400÷（ 0.1×103）×2000＝3×109，则5个中方格中酵母菌不少于30。

故答案为：

（1）pH 高压蒸汽

（2）50℃

（3）abd

（4）氧气 无 30

【点评】本题主要考查对食用菌菌种扩大培养并保存的过程中涉及的培养基配制、灭菌及菌种转移和保藏的一些基础知识，考生需注意归纳总结，才能减少犯错。

32．（8分）为生产具有特定性能的α﹣淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α﹣淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α﹣淀粉酶，实验流程见右图。请回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增α﹣淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。

（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。。

（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）

①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间

（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α﹣淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。

（5）获得工程菌表达的α﹣淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：

缓冲液50mmol/L Na2HPO4﹣KH2PO450mmol/L Tris﹣HCl50mmol/L Gly﹣NaOH

pH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5

酶相对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8

根据上述实验结果，初步判断该α﹣淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，50mmol/LTris﹣HCl。

【考点】3A：探究影响酶活性的因素；Q2：基因工程的原理及技术

【专题】12：图形图表题；51A：酶在代谢中的作用；548：基因工程．

【分析】1．基因工程步骤：（1）目的基因的分离或合成

（2）将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA分子﹣表达载体

（3）将重组DNA分子导入受体细胞，并获得具有外源基因的个体

（4）转基因生物的检测与鉴定

2．PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'﹣3'）的方向合成互补链。

3．酶的活性受温度、Ph等因素影响。

【解答】解：（1）PCR扩增DNA必须有目的基因，对于本题就是细菌的基因组DNA；

（2）在构建基因表达载体时，把获得的目的基因插入运载体要用限制酶分别切割，为了防止环化自连，要用不同限制酶切割，一般在引物5′端加上限制性酶切位点；