33．（8分）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理．PCR扩增过程示意图如图，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR扩增．

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连．

（3）图中步骤1代表变性，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环．

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键．退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对．退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但GC含量高的引物需要设定更高的退火温度．

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有②③（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）．

【考点】L3：PCR技术的基本操作和应用；Q2：基因工程的原理及技术

【专题】111：图文信息类简答题；547：PCR技术；548：基因工程．

【分析】PCR技术：

1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术．

2、原理：DNA复制．

3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物．

4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．

5、过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链．PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开．

【解答】解：（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增．

（2）构建重组质粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点．设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，而不能与模板相连．

（3）图中步骤1、2、3分别代表变性、退火、延伸，这三个步骤组成一轮循环．

（4）退火表示引物与模板相连，若退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对．由于G﹣C之间有三个氢键，A﹣T之间有两个氢键，所以G﹣C含量越高的引物，退火温度越高．

（5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连；或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连．因此，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进．

故答案为：

（1）逆转录 cDNA

（2）限制性核酸内切酶 碱基互补配对

（3）变性

（4）引物与模板 GC含量高

（5）②③

【点评】本题主要考查基因工程的相关知识，要求学生理解PCR的具体过程，以及引物的作用，学会分析引物或温度改变对PCR结果的影响．