③在血球计数板中央滴一滴培养液，盖上盖玻片

④用滤纸吸除血球计数板边缘多余培养液

⑤将计数板放在载物台中央，待酵母菌沉降到计数室底部，在显微镜下观察、计数。

【考点】27：原核细胞和真核细胞的形态和结构的异同；F8：探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化

【分析】根据题意，如图所示的细胞亚显微结构分析可以得到，各结构分别为①细胞壁，②细胞核，③内质网，④核糖体，⑤细胞膜，⑥线粒体，⑦液泡，⑧细胞质基质，再根据各细胞器的功能及特点解答此题即可。

【解答】解：根据解析确定各编号对应的细胞器。

（1）酵母菌和菠菜叶肉细胞都是真核生物，蓝藻是原核生物。由于酵母菌为异养生物，菠菜为自养生物，所以酵母菌中没有叶绿体；而真核细胞与原核生物的最主要区别就在于是否具有由核膜包被的细胞核。

（2）RNA主要分布在细胞质基质中，另外在细胞核、线粒体、叶绿体和核糖体中也会含有少量的RNA。

（3）酵母菌是兼性厌氧型微生物，既可以进行有氧呼吸产生CO2和H2O，也可以进行无氧呼吸产生酒精和CO2；题目中“不能直接分解葡萄糖但能释放CO2”指的是有氧呼吸的第二阶段，是在线粒体中进行的。

（4）使用酶解法去除酵母菌结构①细胞壁，没有了细胞壁的保护作用，如在低渗溶液中，则细胞会吸水膨胀，甚至会涨破，所以最好要放在等渗或高渗溶液中。

（5）在锥形瓶中吸取酵母菌菌液时，要将锥形瓶轻轻地震荡使酵母菌能均匀的分布在溶液中；在血球计数板上滴加溶液时应该是从一侧进行滴加而不是在中央滴加。

故答案为：（1）没有叶绿体 具有核膜包被的细胞核

（2）②④⑥⑧

（3）⑥

（4）等渗或高渗

（5）①④⑤

【点评】本题主要考察了真核细胞亚显微结构模式图，各细胞器的结构和功能，原核细胞和真核细胞的异同，探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验，熟练掌握相关的基础知识是解决问题的关键。

27．（8分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

（1）一个如图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有0、2个游离的磷酸基团。

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。

（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因。

（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。

（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。

（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了鉴别和筛选含有目的基因的细胞。

（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在蔗糖为唯一含碳营养物质的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

【考点】Q2：基因工程的原理及技术

【分析】第一步：目的基因的获取

（1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。

（2）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

（3）PCR技术扩增目的基因

①原理：DNA双链复制

②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建

（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因

①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。